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重组DNA技术为代表的第二次疫苗革命
以Pasteur的工作为代表的第一次疫苗革命基本上是在细胞水平上研究和开发的结果。从20世纪70年代中期开始,分子生物学技术迅速发展,使得从事疫苗研究的科学家得以在分子水平上对微生物的基因进行克隆和表达。与此同时,化学、生物化学、遗传学和免疫学的发展在很大程度上为新疫苗的研制和旧疫苗的改进提供了新技术和新方法(表1.1)。1986年用基因工程制备的乙型肝炎表面抗原获得成功并正式作为肝炎疫苗用于临床。于此前后,肺炎、脑膜炎和流感嗜血杆菌的多糖和多糖蛋白偶联疫苗,以及无细胞百日咳和回归热的纯化蛋白质组分疫苗等等也纷纷通过临床试验,形成了第二次疫苗革命。
  表1.1 新技术对疫苗研制和开发的作用及影响
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学科领域    生物技术              作用和影响
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遗传学  基因工程和DNA重组           抗原鉴定和抗原分离
     (包括基因克隆和表达DNA测序,     测定抗原的可变性
     DNA 合成,核酸内切酶和工具酶,    蛋白质抗原的基因工程
     PCR,全基因图谱)            基因突变和减毒
                         重组微生物作为载体
化学   多肽合成                鉴定抗原表位
                         研制多肽疫苗
     蛋白质结构                计数及估测T和B细胞表位
      糖结构                 多糖疫苗
     基础研究                 佐剂,多糖和蛋白质偶联疫苗
免疫学  单克隆抗体               抗原鉴定和抗原分离
                         鉴定抗原表位
     抗同种异型               模拟非蛋白质表位
     免疫调控                新型佐剂
     基础研究                 细胞和分子免疫机理
                         粘膜免疫
1 重组DNA技术
  和生物学其他领域取得的突破一样,重组DNA技术的应用为疫苗的研究开辟了一个广阔的天地。基因的克隆和表达使得几乎所有微生物的抗原都可以用重组DNA的方法来获得,解决了以往用传统方法来制备抗原和研究病原微生物的两大困难。第一,用传统方法很难获得大量高纯度的抗原供研究和生产。然而重组DNA工程可以提供无穷无尽的材料供试验,而且可以对大量的候选疫苗进行反复的筛选。第二,重组DNA技术使得对病原微生物的研究变得更加安全。因为研究的对象是基因和它们的蛋白质产物,而不是能引起传染病的致病微生物。
  乙型肝炎表面抗原的重组DNA疫苗是最具典型意义的第二次疫苗革命的产物。最初的乙肝疫苗是从乙肝表面抗原阳性的携带者血浆中提取的,这对接种乙肝疫苗的健康人群来讲,其危险性是显而易见的。为安全起见,严格的病毒灭活程序使得乙肝血源苗的生产周期长达65周。将乙肝表面抗原的基因克隆到酵母菌或真核细胞中去,其表达的抗原分子具有和血源苗一样的结构和免疫原性。用重组DNA制备乙肝疫苗,生产简单、快速、成本低。乙肝基因苗不仅安全、效果好,而且可以源源不断地供应临床,不必像乙肝血源苗那样担心阳性血浆的来源和供应问题。
  重组DNA技术可以在基因水平上对细菌毒素进行脱毒。例如采用在体外使基因突变的方法可以使白喉毒素蛋白中的一个氨基酸发生改变,结果既保留了毒素的免疫原性又使其失去了毒性。成功的例子还有破伤风毒素和百日咳毒素的基因突变脱毒。这种方法最终将替代传统的细菌类毒素疫苗,不仅因为安全,而且生产容易,成本也低。
  重组DNA技术和传统的遗传技术相结合可以构建无毒或减毒活疫苗。例如将霍乱弧菌的毒素/4基因、$higa样毒素基因和溶血素/4基因都去掉,就可以获得安全有效的霍乱活疫苗。又如对伤寒杆菌的gale基因或aro基因在体外进行特异部位的突变,使得细菌能保留其侵入细胞和刺激免疫系统的能力,却不能引起疾病。
  另外一种方法是载体活疫苗,其方法是将目的基因克隆到已经在临床常规使用的活疫苗中去,也就是将这种安全的细菌或病毒活疫苗作为载体来表达目的基因,从而达到针对某种传染病的免疫保护作用。常用的载体有卡介苗、腺病毒和痘苗病毒等。
2 化学和蛋白质化学技术
  由于绝大部分疫苗的保护性抗原是蛋白质,因而蛋白质化学技术的发展对疫苗的研制有很大的作用和影响。例如用等电聚焦的方法来分离蛋白质,现在已经可以将等电点仅相差0.01的两种蛋白质加以区分。高效液相层析(HPLC)已能将含量极低的蛋白质成分和其他特性相似的蛋白质分离开来。多肽测序技术的敏感性提高了50-100倍,用量已从20pmol降低到200fmol。
  微生物的抗原在和免疫系统的抗体或细胞受体作用时,其抗体的表位只有3-5个氨基酸;T细胞的表位也只有15-20个氨基酸。现在的氨基酸合成仪能够合成2—50多个氨基酸,其在疫苗的研制方面有两个主要的用途。第一,如果已知一个抗原的一级结构,可以用合成的多肽来确定B细胞的表位。具体方法是根据蛋白质的氨基酸序列合成一系列同样长短的多肽,最短的是8个氨基酸,也可以是10个或更长一点。但是这些多肽必须在其头尾部分有重叠的序列,而且全部多肽连起来要跨越整个蛋白质的完整氨基酸序列。然后用特异的抗体和这些不同的多肽进行反应,其目的是为了寻找抗原中具保护性的B细胞表位。第二,根据已知的B细胞和T细胞的表位合成多肽,直接制备多肽疫苗。当然,由于多肽的相对分子质量太小,这种疫苗必须接上蛋白质载体才具有免疫原性。
  某些细菌的毒力和细菌表面的荚膜多糖和脂多糖有关,例如肺炎球菌、脑膜炎球菌和流感嗜血杆菌等。使用先进的化学技术可以将这些细菌的多糖提纯出来做成既安全又有效的疫苗。由于婴儿的免疫系统发育还不够成熟,单独使用多糖不能刺激免疫系统。采用化学偶联方法将多糖和破伤风类毒素或其他蛋白质偶联就可以弥补这一缺陷。
  长期以来,氢氧化铝是唯一的人用疫苗佐剂。化学和生物学技术的发展开发了许多不同类型的佐剂,据不完全统计大约有数百种,而有关佐剂研究的文献仅1999年就多达上万篇。不同的佐剂有不同的机理来促进免疫反应,有的主要能加强体液免疫反应,而有的则是以提高细胞免疫反应为主。新佐剂的来源十分复杂,有源自于植物和细菌的佐剂;也有人工合成的有机物和无机盐;有的佐剂为综合不同来源的物质配制而成。近年来对细胞因子和多核苷酸佐剂的研究也方兴未艾。但是不论是何种佐剂,评价其好坏或能否适合人用疫苗的3个基本标准则是相同的。
  (1)促进机体免疫反应的能力 产生体液免疫反应和细胞免疫反应,或两者均有;而且疫苗的抗原成分和疫苗的接种途径与有效免疫反应的产生密切相关。
  (2)副作用 佐剂的副作用是局部的反应还是全身性反应,以及副反应的程度能否被使用者接受是一个十分严谨的标准,凡是不安全的佐剂,不论其效果有多佳,也不能用于临床。
  (3)价格 新佐剂的材料来源和制造工艺往往决定了它的价格,而只有价廉物美的佐剂才能普遍被临床所接受。
  此外,还应考虑到使用新佐剂以后,能否减少疫苗的免疫剂量和接种次数以及免疫力持续的时间长短等等因素。

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